狂犬病的流行特点及其动物疫苗研究进展​

3 病毒检测方法

3.1 病毒分离和培养

采集患病动物死后的新鲜脑组织，将组织液注射到乳鼠体内或接种细胞组织中进行培养并扩增，利用免疫荧光技术对病毒颗粒进行检测。该方法适用于对疑似感染的病死动物进行确诊。

3.2 荧光抗体技术

荧光抗体技术(FAT)指脑组织切片用丙酮固定液将其固定后，利用抗原抗体相结合特异性，经荧光抗体染色后，通过荧光显微镜观察脑组织切片样品是否含有病毒颗粒或者病毒包涵体从而进行判断。该方法因操作步骤简单、方便且成本低，被世界动物卫生组织（OIE）所推荐，也是实验室中常用的检测方法之一。

3.3 直接荧光抗体技术

直接荧光抗体技术（DFA）是狂犬病实验室诊断的“金标准”,该技术被世界动物卫生组织（OIE）所认证。该方法是将疑似患病动物的脑组织切片进行固定后，与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的RABV单克隆抗体发生特异性结合，通过荧光显微镜可直接观察病毒颗粒进行判断。该方法快速、特异性好且灵敏，是实验室确诊狂犬病的首选方法。

3.4 快速免疫组化技术

快速免疫组化技术（dRIT）主要用于狂犬病的定性检测。该方法主要采集疑似患病动物的脑组织样品，与特异性RABV单克隆抗体发生特异性的结合后，经过染色后，可直接在光学显微镜下观察是否存在病毒颗粒，从而判断是否感染狂犬病。该方法的特异性和灵敏性与DFA相当，并且所用的仪器没有DFA所用的荧光显微镜昂贵，被大多数国家推广使用。

3.5 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）利用抗原抗体特异性结合原理，将RABV特异性单克隆抗体加入到平板上，加入待检样品与其发生特异性结合后，再加入的辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记物与RABV单克隆抗体进行特异性结合产生显色反应，通过观察显色反应程度判断病原阴阳性。该方法虽然操作简单方便、检测速度快，但敏感性较差，有假阳性或假阴性的情况。

3.6 核酸检测技术

核酸检测RABV通常采用RT-PCR技术，根据RABV的保守序列，利用软件设计特异性的引物，以待检样品为模板，扩增出目的基因片段，根据扩增结果进行判断。快速灵敏的特点适用于大批量样品初筛，但结果时常会受非特异性序列变异、样品采集时间、样品类型、实验环境及实验人员等因素影响，容易造成假阳性或假阴性，因此PCR技术的操作需经过严格培训，保证操作的规范性，避免污染造成结果误差。

4 动物狂犬病疫苗的研究现状

动物狂犬病疫苗经过多年的研究，从神经组织疫苗到现在的基因重组疫苗发生了质的飞跃，疫苗免疫原性增强的同时，免疫副作用也不断减少，目前成为产品的的狂犬病疫苗株通常有CTN-1、aG、PM、SAD、ERA和Flury等。

4.1 神经组织疫苗

神经组织疫苗是利用石炭酸或石炭酸和乙醚的混合物将感染狂犬病毒的羊脑组织进行灭活后制成的，巴斯德在1988年，对50多只犬进行免疫试验，具有较好的保护率。但由于免疫后引起严重的不良反应，目前该疫苗已经停止生产。

4.2 鸡胚疫苗

鸡胚疫苗是利用鸡胚接种RABV后，经多次传代，RABV毒力削弱，使其失去致病性。该方法常用的毒株有Flury和Kelev。虽然该疫苗毒力已经减弱，但是仍然存在一定的感染风险，因此在临床上并不推广使用。

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