口蹄疫等动物疫病诊断技术研究进展

2.口蹄疫分子诊断学方法。荧光定量PCR主要分为两大类，染料法和探针法。荧光探针是在探针的5'端标记一个荧光报告基团(R),3'端标记一个淬灭基团(Q),两者可构成能量传递结构，即5'端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制，当两者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，荧光监测系统可收到荧光信号。

口蹄疫定型荧光定量RT-PCR试剂盒特点：(1)特异性好，覆盖面广，能够检测我国及周边国家目前主要流行毒株;(2)敏感性高，可以检测到10个拷贝/ul；（3）更加高效，能够在一个体系中同时鉴定目前在国内流行的口蹄疫三个型。

3.口蹄疫单抗竞争ELISA抗体检测试剂盒。本试剂盒的判定标准是以病毒中和实验(VNT)为参照，经统计分析发现SPCE方法与VNT的相关性为0.93，其效价与中和效价高度相关，中和抗体与保护效力高度相关。

检测结果既可定血清型，也可以定血清抗体效价。反应特点:(1)特异性好:血清型间，无交叉反应;(2)反应谱广:血清型内，与历史毒株和流行毒株都很好反应。检测特点:可测定血清型，也可测定抗体效价。

4.口蹄疫非结构蛋白抗体检测方法。单抗阻断ELISA抗体检测方法、酶联免疫电转移印迹试验( EITB)或(FMDV Multi-NSPs Dot-blot),2C3AB金标试纸条。

5.口蹄疫分子诊断学方法。荧光定量PCR主要分为两大类，染料法和探针法。荧光探针是在探针的5'端标记一个荧光报告基团(R),3'端标记一个淬灭基团(Q),两者可构成能量传递结构，即5'端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制，当两者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，荧光监测系统可收到荧光信号。

三、其他动物疫病诊断技术

1.禽流感病毒H7N9  (H7hi/H71o/N9)三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。H7N9是A型流感病毒，属单股负链分节段RNA病毒，其基因组编码至少11种蛋白，主要包括表面基因HA和NA蛋白，以及6个内部基因蛋白。H7N9是新型重组病毒，其HA来源于H7N3,NA来源于H4N9等病毒，内部基因来源于H9N2亚型禽流感病毒，该病毒可引起人和鸡发病和死亡。

2.猪病毒性腹泻的四重荧光定量RT-PCTo猪病毒性腹泻的病原种类繁多、感染状况错综复杂，猪肠道冠状病毒四重荧光定量RT-PCR试剂盒结合我国猪场病毒性腹泻最新流行特点，同时检测传统的猪传染性胃肠炎病毒、变异的猪流行性腹泻病毒，以及近年来新发的猪德尔塔冠状病毒和猪A型肠道冠状病毒。

优点:兼容性强、根据各类病毒保守基因全新设计;特异性高，不与其他病毒基因结合;敏感性好，可检测几十个病毒基因拷贝数;荧光信号强、类型通用，常规荧光定量PCR仪均可使用;程序简单、省时省力、精准高效。

3.羊棘球坳(包虫)病自然感染抗体ELISA检测试剂盒。利用蛋白质组学、代谢组学以及结合免疫学新技术，分离鉴定棘球蝴病特异性候选抗原;制备了羊棘球蝴病阳性、阴性血清;建立了羊棘球蝴病血清学间接ELISA诊断方法。

4.猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒。优点:(1)相对于单抗阻断ELISA，该试剂盒具有更好的敏感性，排除了相对单一表位抗体丰度不足时引起的假阳性;(2)相对于国内其他试剂盒，大大缩短检测时间，2n以内可完成检测;(3)该试剂盒具有较好的重复性，同一血清(n=48)，板内变异系数CVGB%，板间变异系数<L0; (4)能够准确、客观的反应免疫效果及血清中特异性猪瘟抗体的相对含量;(5)  1000份血清结果验证，与IDEXX,金诺阻断比对，整体符合率在85%-90%之间。

5.布鲁氏菌cELISA抗体检测试剂盒。布鲁氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒灵敏度达97.9%，是传统方法的5一10倍，适用于对可疑样品的检测特异性可达96.3%，能够有效区分与布鲁氏菌存在血清学干扰的大肠杆菌0157,耶尔森氏菌09等阳性血清。

特点:(1) 《2016-2020年度国家布病防控计划》已将竞争ELISA方法列人动物布病确诊检测方法之一;(2)本试剂盒即是通过特异性单克隆抗体与待检血清中的抗体，竞争性结合包被在ELISA板中的布鲁氏菌抗原;(3)由于其加人针对布鲁氏菌的单抗，与传统方法相比其灵敏度高、特异性强、适用于大部分易感动物如牛、羊等动物;(4)方法操作便捷、耗时短;检测使用酶标显色系统，结果易于判定。

四、兽医实验室诊断操作注意事项

(一)分子诊断实验室的规范化设置

1.分成不同的工作区域。每一区域都须有专用的仪器设备，专用的加样器和枪尖等。标记清晰准确，如加样器或试剂等。单一方向顺序，从准备区、标本制备区、体系混合区及加样区。不同的区域推荐使用不同(颜色)的工作服。实验室的清洁应按试剂储存和准备区至加样区。不同区域使用各自的清洁用具。

2.各区域的功能。(1)准备区功能:储存试剂的制备，试剂的分装;反应混合液的制备及分装;加阴性对照;(2)样本处理区功能:临床样本的处理(破碎)、保存;(3)核酸提取区功能:核酸提取及保存;(4)扩增区功能:将准备区分装好的反应体系和提取的核酸混合，并加阳性对照。

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