鸡传染性支气管炎诊断技术研究进展

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP针对靶基因的6个区域设计多条特异性引物，能在恒温条件下实现对目的基因的快速扩增。该方法已经广泛应用于病毒检测。由于IBV-S2基因高度保守，因此Chandrasekar等以IBV-S2基因建立了RT-LAMP。该方法仅需在60 ℃条件运行45 min即可完成检测，且敏感度比RT-PCR高100倍；将产物使用碘化丙啶染色即可用肉眼判断结果，阳性为粉红色，阴性为橙红色。该方法灵敏度高、耗时短，可作为基层实验室诊断IBV的方法。El-tholoth等建立了在封闭条件下反应的半定量RT-LAMP，消除了检测过程中的污染问题，检测限为1 EID50/mL，能应用于临床样品的IBV筛查。普通LAMP对染料要求较高，而且操作过程出现污染、引物较多使设计复杂、引物之间杂交等因素都可能造成假阳性。

实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） RT-qPCR是一种结合荧光基团实现实时定量的PCR方法。王楷宬等基于IBV核衣壳蛋白基因建立的RT-qPCR的灵敏度可达到10-4 ng/μL，与国家标准方法具有同等的可靠性。金娟等针对IBV-S1基因设计引物和探针，将拷贝数与EID50联系起来，实现对QX型IBV的准确定量。廖凯设计了两套特异性引物和探针，建立了针对TW Ⅰ型的RT-qPCR。该方法对101~109 copies/μL范围内的底物能取得优良的检测效果，且与其他IBV血清型无交叉反应。Karimi等利用RT-qPCR结合4种不同的酶扩增S1基因部分片段，建立了同时检测Mass、793/B、QX和 IS-14194的PCR-RFLP方法。该方法具有与测序相同的特异性，能作为一种简单、快速的方法应用于IBV分型。由于RT-qPCR灵敏度极高，每一个步骤都有可能因为操作不规范造成样品污染或环境污染（特别是当样品中存在强阳性时），因此对操作人员及处理环境有着较高要求。

重组聚合酶等温扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA） RPA技术是一种依赖DNA聚合酶、单链结合蛋白的恒温高效快速扩增技术。El?tholoth等将RT-RPA与核酸层析（nucleic acid lateral flow，NALF）结合，建立了同时检测NDV和IBV的RT-RPA-NALF法。该方法在38 ℃仅需40 min就可以检出两种病毒，并且依靠肉眼就可判断结果，检测限为10 copies/μL。且该方法经过改进后或许可以区分疫苗株和野毒株，与RT-qPCR相比，对条件要求更低且耗时更短，适用于现场快速筛查。Wang等将RT-RPA与横向流动试纸条（lateral flow dipstick，LFD）结合，建立了检测IBV的RT-RPA-LFD。该方法扩增目的基因仅需24 min，并通过LFD可以在3 min内肉眼观察得到结果，检测限为102 copies/μL，灵敏度为104 copies/μL。RPA特异性好，对试验条件要求不高，且灵敏度高、耗时短，适用于养殖场IBV大规模筛查。

3.4 蛋白芯片技术

蛋白芯片技术针对蛋白质而开发，主要包括蛋白质微阵列、微孔板蛋白质芯片、三维凝胶块芯片。Li等建立了一种同时检测AIV、NDV和IBV抗体的三重蛋白芯片技术。与商品试剂盒相比，该方法的敏感性、特异性、准确度均大于99%，能应用于现场快速筛查，但是该方法不能区别自然感染和疫苗接种抗体，因此筛查前要调查疫苗接种史。Yan等结合改性聚二甲基硅氧烷（iPDMS）开发了两种间接微阵列芯片技术：化学发光免疫分析试验和快速诊断试验。除判定方法不同外，反应过程与ELISA类似，与商品试剂盒相比，敏感性和特异性均大于90%，其中快速诊断试验能通过肉眼判定且能在15 min得到结果。但是基于蛋白芯片技术研发的产品在灵敏度和特异性上与RT-qPCR、RPA等仍存在一定差距，仍需进一步优化升级。

3.5 其他诊断技术

除了上述应用较多的诊断方法，近年来还有Liu等以IBV N蛋白和S蛋白单克隆抗体为示踪剂和捕获抗体，建立了能快速、简便检测IBV的免疫层析试纸条，能在10 min内完成检测。该方法与RT-PCR检测结果具有一致性，结合使用单克隆抗体和胶体金单抗示踪剂是鉴别各种IBV基因型的理想选择。Banakar等依靠数据挖掘方法和Dempster-Shafer理论建立了一种禽病诊断装置，利用快速傅立叶变换（fast fourier transform，FFT）和离散小波变换（discrete wavelet transform，DWT）对鸡声信号进行处理，通过声音数据分析，能够快速诊断出NDV、IBV和AIV。该装置的研发为禽病诊断提供了一种新的思路，但其实用性仍需进一步探究。

4 结语

IB诊断方法主要有病毒分离、血清学诊断、免疫组织化学技术、分子生物学诊断、蛋白芯片技术。病毒分离耗时长且对操作有一定的要求，因此近年来将病毒分离与基因测序分析相结合已经成为诊断IBV及鉴别其基因型的重要手段。在常规血清学方法中，ELISA和HI是推荐用于鸡群大规模筛查及免疫效果评价的方法，已经有商品化的ELISA试剂盒。IHC已经较少应用于IBV的诊断及筛查。随着分子生物学技术的发展，PCR技术因其更高的准确性，且能实现实时定量分析，已经被广泛应用于实验室检测；RPA技术作为有着极大发展潜力的新技术，将其与NALF或LFD相结合，不仅耗时短，对条件要求低，而且能肉眼判断结果。另外，蛋白芯片技术、免疫层析试纸条、鸡声信号分析装置也为IB诊断提供了全新的思路。

首页前一页123后一页尾页