非洲猪瘟诊断技术研究进展（二）

摘要：非洲猪瘟防控目前暂无安全有效疫苗可用，因此快速、可靠的检测方法对其防控至关重要。目前应用的非洲猪瘟诊断技术主要表现在病原、核酸、抗原与抗体四个方面：病原检测主要有红细胞吸附和病毒分离方法，核酸检测目前已开发出实时荧光定量PCR（qPCR）、多重PCR（mPCR）、微滴数字PCR（ddPCR）、巢氏PCR（nested-PCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）、交叉引物扩增技术（CPA）、原位杂交技术（ISH）以及生物传感器技术等，抗原检测常用荧光抗体试验（FAT）、抗原ELISA、侧向流动免疫色谱分析（LFA）等，而抗体检测主要通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光抗体试验（IFA）、胶体金快速免疫层析法（GICA）、免疫印迹法（IBT）等方法。每种诊断技术都有其特点，从而为不同情况下的ASFV诊断提供了多种选择。未来，其他技术如CRISPR等与上述技术的结合应用，以及不同诊断技术的联合应用，将成为非洲猪瘟诊断技术发展的趋势。

非洲猪瘟（African swine fever ，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的一种急性、高度接触性、高致病性传染病。ASFV 是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，也是目前已知的唯一 DNA 虫媒病毒。ASFV 基因组是一个大型线状双链 DNA 分子，主要在单核巨噬细胞及网状内皮细胞中复制，长度为 170~190 kbp，编码150 多种蛋白，包含中间保守区和两端可变区。根据 p72 蛋白编码基因（B646L）末端约 500 bp 核苷酸的差异，已鉴定出 24 种 ASFV 基因型。世界动物卫生组织（OIE）将 ASF 列入须通报动物疫病名录，我国将其列为一类动物疫病。目前暂无有效疫苗来预防该病。感染 ASFV 会产生各种综合症，从最急性、急性到慢性，以及无症状的病毒携带，最主要临床特征表现为高热、出血和全身皮肤发绀坏死，尸体剖检可见脾脏充血、肿大，淋巴结、肝脏和肾脏出血等。这些临床特征及病理变化与猪瘟（CSF）、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）以及猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）尤为相似，难以鉴别，所以需要借助实验室诊断来确诊。

本文综述了目前应用的 ASFV 检测技术，并对各种方法优缺点进行比较分析，同时探讨了未来诊断技术发展趋势，以期为我国 ASF 防控提供技术参考。

1　ASF 病原学检测

1.1　病原检测

1.1.1　病毒分离鉴定　ASFV 感染动物后，主要在单核巨噬细胞系统（单核细胞和巨噬细胞）中复制，并通过淋巴系统和血液循环系统扩散到肝、肾等器官。《OIE 陆生动物诊断试验与疫苗手册》要求，ASFV 分离必须在 BSL-3 及以上生物安全实验室进行，且需要从血液、脾脏、肝脏、淋巴结和扁 桃体等组织样本中分离病毒，用于下一步的实验室诊断。

1.1.2 红细胞吸附试验（haemadsorption test，HAD）　红细胞吸附性是在 1960 年由 Malmquist和 Hay 首次发现的。ASFV 会粘附于猪的单核细胞或巨噬细胞表面，产生特征性的“玫瑰花环”现象。采集发病猪的血液或组织悬液接种到猪原代骨髓细胞（PBM）、原代白细胞或肺泡巨噬细胞中进行培养，6 d 后确定结果。通常，如果样本呈强烈阳性，则会在培养后 24~48 h 出现血液吸附而形成特征性的“玫瑰花环”现象。为防止非特异性的红细胞吸附，培养基中需添加猪血清或血浆。虽然该方法敏感性高、成本低，但需要进行原代细胞培养，时间周期长，而且现已分离出少量“非血吸附”的ASFV，其中大多数是低毒性的，不产生红细胞吸附现象，所以 HAD 不再是检测 ASFV 的首选方法，一般将 HAD 与病毒分离鉴定作为 ELISA、PC R 或FAT 阳性结果确认的参考试验。

1.2　核酸检测

1.2.1 PCR PCR 全称为聚合酶链式反应，由变性、退火、延伸 3 个基本反应步骤构成，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR用于检测血液、血清或器官样本中的ASFV基因组，在 ASFV 感染早期就可通过 PCR 检测到 ASFV。病毒脱氧核糖核酸的小片段可通过 PCR 扩增到可检测的数量。该方法快速、敏感性高、特异性强。所有已知基因型的病毒分离株，包括非血液吸附毒 株和低毒力分离毒株，都可以用 PCR 检测，甚至灭活或降解的样品都可以检测。Agüero 等发现，ASFV 引物集可以与 CSFV 的特定引物集相结合，采用多重反转录 PCR（RT-PCR）方法，可以在一次反应中同时区分并检测两种病毒基因组。然而，PCR 敏感性高，样品稍有交叉污染，就会导致假 阳性结果。为此，Luo 等基于 GenBank 中所有ASFV 毒株 VP72 基因序列的高度保守区，设计了ASFV 特异性引物，建立了 PCR 检测方法，并与两个 OIE 验证的 PCR 检测进行了比较，结果表明灵敏性和特异性都高于 OIE 推荐的 PCR 方法。

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