全球基因I型非洲猪瘟病毒流行与疫苗研究进展

这说明敲除 DP96R 和 EP153R 基因后并没有增加 BA71ΔCD2 的安全性，反而使其攻毒保护能力降低。此外，研究者还以 Benin 97/1 强毒株（1971 年分离自西非贝宁共和国发病猪场）为骨架敲除了 MGF 基因BeninΔMGF）。结果显示：BeninΔMGF 接种 2 次（肌肉注射，首免 102TCID50/ 头，25 d 后第二次免疫，104 TCID50/ 头）后出现一过性体温升高，无任何临床症状。一次免疫后第 46 天，使用强毒株 Benin 97/1 进行攻毒（104 TCID50/ 头，肌肉注射），体温、临床表现均正常。相似的，以 Benin 97/1 强毒株为骨架敲除了 DP148R 基因（BeninΔDP148R），接种 2 次（肌肉注射，首免 103HAD50/ 头，21 d 后重复加免1 次）后出现一过性体温升高（持续 1~2 d），无任何临床症状。一次免疫后第 42 天，使用强毒株Benin 97/1 进行攻毒（104HAD50/ 头，肌肉注射），结果 2 头猪出现体温升高，其余 3 头猪体温、临床分析以上所有基因缺失毒株结果，可以推断基因敲除策略可以提高毒株的安全性和保护效果，但具体基因的使用搭配等需要进行大量试验验证，目前还未有理想的基因 I 型基因缺失疫苗候选株进一步进行临床试验。

2.3 细胞传代致弱株

葡萄牙弱毒活疫苗（以 1960 年分离的 Lisbon60 毒株或 1961 年分离的 1455 毒株为母本毒株，在猪骨髓细胞上连续传代所得）临床试验终止后，虽然再没有进行过大规模的相关试验，但可以明确的是，非洲猪瘟病毒经过细胞连续传代可以导致毒力减弱。以此为理论依据，研究者对非洲猪瘟强毒株进行了多种细胞系的传代适应改造，研制了多种细胞传代致弱株并进行了动物试验评价。

但因基因分型技术早期还无法应用，所以细胞传代致弱株的研究一开始并没有特别关注基因 I 型，而是对现有分离株进行了多种尝试。如Hinde毒株（分离自肯尼亚，可能为基因 X 型）和 Tengani 毒株（分离自马拉维，可能为基因 V 型）分别在猪肾细胞（1968 年）和幼仓鼠肾细胞（1974 年）中连续传代致弱。基因 I 型的传代致弱株研究主要是以西班牙或葡萄牙本地分离株为主，如经典毒株BA71v（将 1971 年西班牙分离株 BA71 在 Vero 传代致弱）和 E75CV1（将 1975 年西班牙分离株在猴肾成纤维细胞传代致弱）。进一步研究显示，家猪接种 E75CV1（104HAU50/ 头，肌肉注射）能全部存活且能抵御同源强毒株（E75，104HAU50/头）的攻击，但 105 HAU50/ 头和 102 HAU50/ 头接种组的存活率均为 50%（2/4）。近期文章显示，俄罗斯联邦病毒学和微生物学研中心（原全俄兽医病毒学与微生物学研究所）对细胞传代致弱株也进行了大量研究，特别是对基因 I 型细胞传代弱毒株 FK-32/13（将法国 1964 年分离株 France-32，在猪骨髓细胞传代 135 代致弱）进行了深入研究。试验数据显示：家猪接种 FK-32/135（107.3HAU50/ 头口服接种，或 106.7HAU50/ 头肌肉注射）后临床反应程度在正常范围内且能抵御同血清群强毒株的攻击（保护率为 80%~100%）；进一步浓缩，使用25 倍浓缩剂量（108.3HAU50/ 头，肌肉注射）接种后可在 7 d 时产生 80%~100% 的攻毒保护效果，免疫保护期达 4 个月且不干扰其他病毒疫苗效果；使用 100 倍浓缩剂量（109.2HAU50/ 头，肌肉注射）接种后最快可在第 3 天对强毒株（France-32，104.0HAU50/ 头）产生 100% 的免疫保护。分析以上所有细胞传代致弱株结果，可以推断细胞连续传代可以达到致弱非洲猪瘟病毒的目的。但要对其进行科学评价特别是合适传代次数的筛选，需要开展大量试验验证，工作量巨大且具有一定的盲目性和随机性。

3　流行演变推测及防控策略

根据国外基因 I 型自然弱毒株（NH/P68 和OUR T88/3）研究数据和国内基因 I 型分离株（HeN/ZZ-P1/21 和 SD/DY-I/21）试验数据，可以判断国内分离的基因 I 型毒株仍具有一定毒力，仍会导致一定的临床表现，特别是关节肿胀、皮肤坏死等非洲猪瘟慢性病程典型症状，而且具有一定的水平传播能力。基因 I 型毒株与基因 II 型毒株（强毒株、变异株）共同在国内存在，提示当前防控形势更加复杂，特别是冬季来临后，低温环境对消毒剂会产生一定的影响且正好满足非洲猪瘟病毒低温环境抵抗力强的特点。因此，假如阳性病例出现后净化不彻底，病毒可能会进一步污染屠宰场、市场，乃至人员日常接触频繁的纸币、日常用品等，并导致环境病毒载量居高不下，给猪场造成巨大的传入风险。在此情况下，深入了解环境病毒污染面，及时进行消毒灭源工作极其重要。

基因 I 型病毒与基因 II 型病毒基因组序列存在一定差异，特别是 CD2v 和 MGF（多基因家族）部分区域差异较大。现有的常用荧光定量诊断方法（以 P72 基因为靶基因）或三重荧光定量方法（以P72、CD2v 和 MGF 基因为靶基因）需要进行更深入的评价，确定其对基因 I 型毒株的敏感性或特异性是否发生变化。此外，对于毒力较弱的基因 I 型毒株或基因 II 型变异株，血清学诊断方法具有一定的差异优势，因此也需加快其产业化报批进程并适时推广应用。同时，非洲猪瘟病毒已在我国定殖并形成较大污染面，进行疫病间交叉感染影响及多种疫病的多重诊断方法研究也具有一定实际意义。

非洲猪瘟在长时间流行传播过程中存在毒力减弱趋势，结合临床中已经发现的基因 I 型毒株和基因 II 型变异株，未来临床中出现症状温和，乃至无任何临床症状的非洲猪瘟病例可能增加，这会导致出现“耐过猪”/“存活猪”现象并难以早期发现，值得警惕和重视。

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