你了解Ct值真正的含义吗？

对于奋战在防非一线的人来说，Ct值不是个陌生的名词，但据笔者的了解，似乎并不是所有人完全理解Ct值的含义。本文尝试简单梳理一下关于Ct值的一些背景知识。

一、什么是PCR？

想要知道Ct值，先要了解PCR。PCR，聚合酶链式反应，DNA聚合酶介导的合成DNA链的反应。是对目标DNA片段进行扩增（大量的翻倍复制）的方法。

为什么需要对DNA片断进行扩增？因为通常情况下病毒DNA的含量太低了，即使是经过了提纯，仍然没办法直接测量有无和多少，所以需要通过PCR技术扩增。以目标DNA为模板，对这段DNA进行复制粘贴，使这段DNA能够检测到，甚至达到可以用肉眼看的到的量。

扩增一次需要一个特定流程，即通过高温使一个双链DNA拆成两个单链，然后降温到聚合酶的活性温度，聚合酶以两个单链DNA作为模板，又生成两个新的双链DNA，即实现了对原来DNA片段的“克隆”。所以我们使用的PCR仪，本质是一个温控设备，而其中用到的聚合酶当然也必须是可以耐高温的聚合酶。

如何确定要复制哪一段DNA呢？这时候就需要使用引物（与目标DNA序列互补的一个短片段）来开个头，从而引导后续的合成，这样就确保只对目标DNA序列进行扩增。

通过一次这样的程序，1个目标DNA片段变成了2个。而之后的流程则是重复这个程序，所以一个这样的程序称为一个循环（Circle）。原理上，如果只有1个目标DNA片段，经过1次循环获得2个同样的DNA片段，如果经过5次循环得到2^5个同样的DNA片段即32个，如果40个循环得到2^40次方个这个DNA片段，即1,099,511,627,776个。当然如果送检样本里没有目标DNA，0^40次方仍然是个0。

注意这里有个前提，就是必须有足够量的合成原料，即引物和游离核苷酸。所以PCR反应中产生的DNA片段与细菌增值曲线类似，前期指数增长，后期如果原料耗尽则曲线拉平。

二、Ct值的含义

在PCR技术的基础之上，通过一定的技术设计，可以实现对合成的DNA的数量进行实时定量检测，也就是实时定量PCR技术，qPCR。

而测量的方法则一般是通过检测荧光信号的强度来实现，比如我们可以在反应体系中加入某种荧光染料（方法之一），这种染料特异性的掺入DNA链之后就会发出荧光。结果制造出的目标DNA片段数量越多，则发出的荧光越强。

给荧光强度设定一个检测阈值，即所需测量的荧光的强度超出背景荧光强度的临界点（也就是Ct中的t，threshold），当需要测量的荧光强度超过这个阈值时，这个时候跑了多少个循环（Ct中的C，即代表Circle），如果跑了25个循环，那么Ct值就是25。

当原始样本中目标DNA的越多，达到这个临界值所需要的循环次数越小，所以Ct值越小意味着，原始样本中这种DNA的浓度就越高，对于非瘟检测来说，就是非瘟感染越严重。

通常实时定量PCR跑40个扩增循环，如果Ct值小于29被认为是强阳性，如果Ct值在30-37之间认为是阳性，Ct值在38-40之间，则可能是含有最小量的目标DNA，也可能是环境污染导致。