欧洲型蓝耳病在中国台湾爆发

摘要：猪繁殖与呼吸综合征对全球养猪产业造成了严重的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征俗称“蓝耳病”，蓝耳病毒分为两个血清型：PRRSV 1型（欧洲型）和 PRRSV 2型（美洲型）。在中国台湾蓝耳病毒分离以PRRSV 2型（美洲型）为主：主要造成保育猪呼吸道问题。2018年10月到11月，在中国台湾中部一猪场出现怀孕母猪流产、产死胎，仔猪表现呼吸道症状，实验室检测证实在母猪和哺乳仔猪血清中存在 PRRSV 1（欧洲型）病毒。分离到的蓝耳病毒与欧洲型蓝耳病毒全基因比对同源性为98.2%；这株本土分离到的欧洲型蓝耳毒株命名为 PRRSV/NPUST-2789-3W-2/TW/2018 (NPUST2789)。本报告证实在中国台湾第一次发现欧洲型蓝耳病毒的爆发且与欧洲型蓝耳疫苗毒株有着共同的进化祖先。

1 导言

猪繁殖与呼吸综合征（蓝耳病）是全球猪业面临最具有经济破坏性的疾病之一，蓝耳病毒最早在1990年发现。一项回顾性研究分析发现早在1979年加拿大样本中就存在蓝耳病毒抗体。蓝耳病毒是囊膜大小约15kb的正链RNA病毒。近几年蓝耳病毒重新划分为β-动脉炎病毒，属于动脉炎科的猪动脉炎病毒属，其分为两个血清型欧洲型和美洲型，两者基因同源性为60%。

蓝耳病毒感染后可在猪群各阶段表现临床症状，主要为厌食、高热、呼吸困难、流产、产死胎或者造成死亡，可无症状感染或造成严重的破坏性。哺乳仔猪可通过垂直传播或水平传播感染，表现为精神萎靡、消瘦、腿部肿胀、呼吸困难和断奶前死亡率增高。蓝耳病从发现迄今已有30年，目前蓝耳病主要使用疫苗防控，然而现在使用的弱毒疫苗不足以清除病毒。弱毒疫苗可以产生体液免疫和细胞免疫，但弱毒疫苗会出现毒力返强和与野毒株重组或者不同弱毒疫苗株间的重组。因此弱毒疫苗的安全性和交叉保护性值得进一步研究。

据报道亚洲国家包括中国大陆、日本、韩国、泰国和越南都存在欧洲型和美洲型蓝耳病毒的流行。在中国台湾北美型蓝耳病毒占主导地位，欧洲型蓝耳病毒存在但没有造成严重的经济损失。本研究中，我们发现了台湾未出现过的欧洲型蓝耳株疫情，报道了病毒基因遗传学分析，与欧洲型蓝耳弱毒疫苗同源性接近，并命名为PRRSV/NPUST-2789-3W-2/TW/2018 (NPUST2789)。

2 材料与方法

2.1 临床病例

2018年10月到11月在台湾中部一个550头母猪的自繁自养农场出现怀孕母猪流产、产死胎、仔猪表现为呼吸道症状。该农场有良好的外部生物安全管理且没有流行性腹泻病毒。在此之前猪场未接种蓝耳疫苗，台湾屏东科技大学（NPUST）动物疫病诊断中心（ADCC）判定为蓝耳阳性稳定场，母猪和仔猪均没有表现临床症状。

2.2 样品准备和蓝耳病毒核酸检测

采集发病猪只血液送往台湾屏东科技大学（NPUST）动物疫病诊断中心（ADCC）。使用总核酸提取试剂盒、核酸自动提取仪从血清样本中提取总核酸，通过荧光定量PCR检测蓝耳病毒。

引物序列为：

PRRSV M177F (5′-CATTCTGGCCCCTGCCCA-3′),

PRRSV M177R (5′-ACCACTCCYYGYTTDACAGCT-3′)，

以M蛋白为靶点的PRRSV 1（ZNA）核酸探针 (HEX-CGCTGTGAGAAAGCCCGG-ZNA4 BHQ1)和

PRRSV 2（ZNA）核酸探针

(FAM-CTCGTGTTGGGTGGCAGA-ZNA4 BHQ1)。

2.3 血清

血清样本使用IDEXX公司的PRRSV抗体检测试剂盒检测，样本与阳性对照比值（S/P）≥ 0.4时样本判定为抗体阳性。

2.4 病毒分离和全基因测序

从血清中分离病毒，将0.5mL蓝耳阳性血清添加到MARC-145细胞中然后每天观察细胞病变，收获病毒载量最高时的培养液用于全基因测序。使用全自动核酸提取仪从培养液中提取病毒核酸，根据Illumina TruSeq DNA制备方案处理核酸，系统建立好后通过NovaSeq 6000系统进行第二代测序（NGS）。

2.5 开放阅读框5（ORF5）的扩增和测序

参考已有文献将ORF5进行基因扩增和测序，使用ABI3730XL DNA分析仪从正反方向进行测序。

2.6 测序和遗传学分析

本分离毒株测序后的全基因序列与蓝耳其他参考毒株做对比，结果见表1。在分子进化遗传学分析X软件（MEGA X）中，用Clustal W方法对核酸序列进行多重比对。在MEGA X中使用基于Kimura 2参数模型的最大似然法构建系统发育树。用MegAlign软件（Lasergene，DNASTAR，Madison，WI，USA）测定核苷酸和氨基酸的序列一致性。SimPlot v3.5.1软件在沿基因组比对（20bp步长）滑动的200bp窗口内绘制了相似性与位置的关系图。

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