非洲猪瘟——我国养猪业的重大威胁

3.1.2血清学检测方法 用于诊断 ASFV 感染的主要血清学方法包括 ELISA 抗体检测、间接免疫荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody assay，IFA)等。ELISA 抗体检测是国际贸易中 OIE 指定的 ASF 诊断方法[4]。基于全病毒抗原或表达抗原(如 p72、p54 等) 的间接 ELISA 或利用针对某一蛋白(如 p72)的单克隆抗体建立的阻断 ELISA 方法可以检测血清中的ASFV 抗体，主要适用于亚急型和慢性 ASF 的诊断。当 ELISA 检测结果不确定或制备抗原困难或复杂时， 可选用IFA 方法。

3.2 疫苗研究进展

3.2.1灭活疫苗 ASF 灭活疫苗免疫猪后可检测到ASFV 特异性抗体，但是没有保护作用，未来研发前景不大[40]。

3.2.2核酸疫苗 细胞免疫和体液免疫应答均在抵抗病毒感染和清除病毒中发挥作用[41-42]。抗体与ASFV 诱导的保护性免疫应答相关，其介导的保护性反应可有效延缓疾病的进程。CD8+ T 细胞反应在ASFV 感染的保护性免疫反应中发挥关键的作用。ARGILAGUET 等将 ASFV 血凝素(sHA)、p30 和p54 胞外域融合真核表达质粒免疫猪后无法抵御ASFV 强毒株的攻击。随后，将这 3 种病毒抗原连接到泛素上，用其免疫可诱导特异性 T 细胞应答，在不产生抗体的情况下，对致死性 ASFV 的攻击起到部分保护，确定了 T 细胞反应在 ASFV 感染保护中的作用[43]。为进一步研究能够刺激 CD8+T 细胞反应的潜在免疫保护区，LACASTA 等通过表达文库构建了上千个表达质粒(ASFVUblib)，并对其进行了免疫攻毒保护试验，其保护率只有 60%，但免疫攻毒后存活猪无排毒现象[44]，为有效疫苗的研发迈出了重要一步。事实上，ASFV 的 p30、p54和 p72 蛋白单独或与其他病毒蛋白混合免疫，均能产生较高水平的抗体，并使血液中病毒含量显著减少，如何更有效地将细胞免疫和体液免疫结合，提高保护率，是 ASFV 核酸疫苗研发的关键和面临的难题[45]。

3.2.3 亚单位疫苗 ASFV 基因组含有多达 167 个开放阅读框，这种蛋白编码的复杂性使得有效保护性抗原的筛选工作十分困难。因此 ASFV 亚单位疫苗的研制举步维艰。目前已证实多个病毒蛋白能够诱导中和抗体，其中 p54和 p30参与病毒的吸附和内化过程。但表达 p54 和 p30 的重组杆状病毒不能保护猪免受ASFV 强毒株的攻击[46]。此外，同时表达 p30、p54、p22 和 p72 的杆状病毒尽管能诱导产生中和抗体，但仍无法保护猪免受 ASFV 强毒株的攻击[47]。这些数据表明，抗体介导的中和作用在 ASFV 诱导的保护中并不起关键作用。在另一项研究中，表达CD2v/EP402R 蛋白的杆状病毒可以对 ASFV 同源毒株的攻击提供部分保护[48]。这可能与诱导产生的抗体能够抑制血细胞吸附(HAD)以及暂时抑制病毒的感染有关。

3.2.4 病毒活载体疫苗 针对 ASFV 的病毒活载体疫苗研究相对较少，目前已经开展的研究主要选用了痘病毒和腺病毒作为载体。LOPERA-MADRID 等利用反向疫苗学技术筛选了 5 种 ASFV 抗原，在HEK293 细胞中表达 B646L(p72)、E183L(p54)和 O61R(p12)，并在经过减毒的牛痘病毒安卡拉(MVA)株病毒载体中表达 B646L、EP153R 和EP402R(CD2v)，将上述蛋白按照不同组合通过初次免疫-加强免疫(prime-boost)策略免疫猪后，可以诱导 ASFV 特异性抗体和 T 细胞反应[49]。为了鉴定更多的 ASFV 免疫原性基因和潜在的保护性抗原，JANCOVICH 等分别在质粒载体和重组牛痘病毒中克隆了 47 个 ASFV 基因用于免疫，利用 DNA 初次免疫和重组牛痘病毒加强免疫猪。经 Georgia 2007/1株攻毒后，免疫猪的血液和淋巴组织中的 ASFV 基因组水平明显降低，但猪只出现了与急性 ASFV 一致的临床和病理变化[45]。LOKHANDWALA 等先后将 ASFV 的保护性抗原重组至人 5 型腺病毒载体和复制缺陷型腺病毒载体中，通过“鸡尾酒”式混合免疫后能够在猪体内诱导高水平的体液免疫和细胞免疫应答[50-51]。但该研究未涉及动物攻毒保护试验，因此所构建的病毒活载体疫苗的效力还有待验证。

3.2.5 ASFV 减毒活疫苗和基因缺失疫苗 ASFV 减毒活疫苗可以诱导针对相同基因型 ASFV 毒株的有效免疫保护，但是对不同基因型 ASFV 毒株不能提供有效保护[52-53]，这可能与病毒特异性 T 细胞反应有关[54-55]。这也是制约 ASFV 疫苗研发的一个难题。自然致弱的减毒活疫苗 ASFV OURT88/3 株 和NH/P68 株可以保护相同基因型 ASFV 毒株攻击，但对不同基因型 ASFV 毒株仅有部分的保护力。同时这些减毒活疫苗免疫后引发病毒血症和肺炎、关节炎等副反应，有一定的安全隐患[52-53]。目前减毒活疫苗的研发主要集中在提高安全性和增强对不同基因型的保护力方面。缺失病毒-细胞互作基因(A224L、A238L和 A276R)的重组 NH/P68 株虽然对相同或者不同基因型(Armenia 2007 株)有 60%—100%的保护力，然而该疫苗株也产生病毒血症和副作用。在猪肺泡巨噬细胞(PAM)中培养的 NH/P68 株能对相同或者不同基因型 ASFV 攻击提供良好的保护，且在免疫后不表现明显的亚临床症状，在不同的细胞中培养的ASFV 免疫猪后表现出不同的保护性[56]。通过基因工程手段构建的缺失 9GL 和MGF360/505 的 Georgia 2007/1 株虽然使病毒的毒力减弱，但是不能对相同基因型的亲本毒株攻击提供有效的保护[57]。目前，通过同源重组构建的 Georgia 2007/1 株 9GL 和 UK 基因缺失减毒活疫苗可以对相同基因型 ASFV 的攻击提供 100%保护力[58]。为研究安全有效的 ASF 疫苗，各国的科学家们进行了大量的尝试。MONTEADGUDO等发现，删除ASFV BA71 株的 CD2v(EP402R)基因(BA712RA7)后可以显著降低其毒力，将该基因缺失病毒免疫猪只后可以对 BA71 的攻击提供 100%的保护力，同时也可以抵抗目前在东欧流行的基因II 型 Georgia 2007/1 株的攻击[59]。该研究结果对于研发具有交叉保护力的 ASFV 减毒活疫苗具有重要借鉴意义。

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