国内外口蹄疫疫苗质量监控技术的研究进展

疫苗质量控制在口蹄疫疫苗生产程序中非常重要。生产合格的高品质疫苗是预防口蹄疫的重要保证。由于不同国家和地区及不同实验室所采用的监控技术方法不尽一致，所以迄今国际上还没有一个统一的标准方法来控制疫苗质量。本文对检测口蹄疫疫苗中间品和成品的的各类方法作简介。

1.生产过程

1.1 质量控制

口蹄疫灭活疫苗的生产必须严格在 GMP 标准级的厂房内，要在QA系统的框架内，按照规定的制苗规程来进行，必须达到可以防止任何源自生产工厂的病毒逃逸的生物安全级别。

GMP 生产车间内应严格密闭，在与外界相通处要安装双 HEPA 过滤器来过滤所有的空气，疫苗的生产应在无菌的不锈钢管道内或其他生产线设备中进行，在活病毒存在的区域内要产生规程要求的梯度负压级别，材料和人员进出负压区均需消毒等一系列的措施。

严格保证制苗原辅料品质：由于口蹄疫疫苗配制成分中有很多生物源性的材料，例血清、蛋白胨和动物源性水解乳蛋白等，所以必须要求这些产品的供货商提供相关品质检验报告。例欧盟的 1999/104/EC 官方指令明确要求检测这些原料产品中是否含有牛海绵状脑病病毒。

疫苗用种毒株的质量直接影响到终产品的好坏，所以应严格加以控制。理想的种毒应该具备以下特性：在细胞培养物上容易生长、病毒产量高、稳定性强以及抗原谱广，具有良好的抗原性和免疫原性；官方的监察实验室应按照疫情流行特点对生产用种毒毒株进行筛选、定性和分发；由于口蹄疫病毒本身具有容易发生变异的特点，因而有必要建立和完善种毒的种子批制度，同时种毒的传代次数也应尽可能的少；所有生产用毒株应由官方的口蹄疫参考实验室标明其生物学特性并分类保存。目前，口蹄疫疫苗生产厂家一般都是使用乳仓鼠肾细胞（BHK-21）克隆 13 传代细胞系，进行悬浮培养。

细胞单层培养系统属于劳动力密集型的生产系统，人为不确定因素多，相对容易污染和散毒，因而提高生产工作人员的专业技能和无菌操作技术是关键因素，必须按照 GMP 规范所要求的，生产人员经培训合格后方可上岗。悬浮培养系统属于技术密集型生产系统，操作相对容易，并且不易散毒，因而保证整个生产密闭系统内的无菌状态，调节好细胞生长的各种最佳生长条件是更加重要的。

口蹄疫的双价苗生产技术已经成熟，并用于大批量的生产。对于其质量控制最关键的部分在于必须保证各型口蹄疫病毒的种毒保存和生产彼此在严格隔离的环境中，在病毒被灭活前，严防两型病毒的相互交叉污染。同时应注意口蹄疫病毒血清型抗原性差异及配制联苗时，调配抗原的比例。

病毒灭活剂的选择是非常重要的。乙烯亚胺类衍生物是较为理想的灭活剂，它可以直接破坏病毒的核酸，比传统灭活剂甲醛更加安全，同时它对病毒抗原蛋白的破坏力更小，因而使疫苗具有更好的免疫原性。灭活时使用双灭活罐系统，更加保证了病毒灭活的彻底性，必须达到每 10000 升病毒灭活液里含有的活病毒粒子要少于 1个，相当于200万头份剂量的疫苗液中，不能有多于 1 个活病毒。2004 年巴西的 Daniella Ishimaru 等人报道了使用流体高压来灭活口蹄疫病毒，他们对 FMDV O1 Campos-vallee（CVa）株进行了试验，在 -15℃使用 2.5 千帕的液体高压，同时加入 1M 尿素来对 FMDV 进行灭活。结果发现病毒完全丧失了感染性，同时病毒本身的衣壳蛋白结构没有被破坏，并保留了诱导兔体产生中和抗体的能力。这种方法安全、简单、便宜并且可重复性好。

为了获得高效的疫苗，同时降低疫苗中非病毒蛋白引起的变态反应，对灭活后的病毒液进行抗原的纯化浓缩是控制疫苗质量的关键步骤之一。当前应用于大规模工厂生产的纯化浓缩方法主要是超滤法、聚乙二醇（PEG）或聚乙烯氧化物（PEO）沉淀法和色谱柱过滤法等。选择质量优良的超滤系统是重要的，必须严格保证超滤系统的无菌，同时定期检查和更换滤芯确保纯化浓缩的效果。

使用优良的佐剂是提高疫苗质量的重要方法。目前，我国所使用的佐剂以矿物油为主，由于国产矿物油纯度和均匀性有待提高，引起的动物体的副反应很大，因而探索研究新型高效副反应小的佐剂成为了迫切的需要，例如 Montanide ISA206 和ISA205 的使用就大大的简化了疫苗的配制，2000 年 印 度 的 A.V.Iyer 等 人报道了他们比较了 ISA206、ISA57 和ISA50V 三种油佐剂所诱导的动物体保护应答效果，发现 ISA57 诱导动物体保护免疫应答效果最好。最近有报道称用分枝杆菌细胞壁的可溶性部分、合成硫辛酰胺、avidine 等作佐剂生产FMDV 油佐剂灭活疫苗，可以降低抗原的用量，同时增强 FMDV 的细胞免疫应答。此外，能够将抗原定向于网状内皮系统、延长抗原免疫刺激时间、降低疫苗副反应的脂质体佐剂、一些能够显著增强免疫效果的牛源和猪源细胞因子（牛 IFN-α、猪 IL-18 和IFN-β）和更多的具有低毒、无免疫原性、安全性好且具有优良生物相容性的可生物降解微球蛋白等新型佐剂的研究和开发将对提高疫苗质量起到更重要的作用。

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