细菌分离培养法

   1．需氧菌分离培养法

（1）平板划线法

此法为分离培养细菌的常用方法，其目的是使被检材料作适当稀释，以便经过培养后得到单个菌落，便于分离纯培养，鉴别菌落的性状。平板划线的方式有多种，可按自己的习惯选用其中之一，但注意不要划破琼脂，不得重覆划线；否则难以获得单个菌落，影响对菌落性状的观察。左手取琼脂平板，用拇指、食指和中指夹住平板边缘，轻轻掀开平板盖使之成一狭缝，并靠近火焰旁。右手持接种环于酒精灯火焰中烧灼灭菌，待其冷后蘸取待检材料少量，自己选择一种平板划线方式划线。划毕，将接种环烧灼灭菌后，直立于试管架上。平板底上记明被检材料名称、日期，置培养箱中培养。

（2）倾注法

取三支已融化的普通琼脂培养基管，冷至约50℃，用接种环取一环培养物于第一管内，随即用两手掌心搓转振荡，由第一管取入第二管，搓匀又从第二管取出一环至第三管振荡后，分别倒入三个灭菌空平板内，摇匀待凝固后，倒置于37℃温箱内培养，24h后观察结果。第一个平板菌落最多，第二个、第三个递减，可得到单个菌落。

2．厌氧菌分离培养法

（1）肝片肉汤培养法

取肝片向杨培养基置水浴煮沸5min，置冷水中冷却，排出空气。接种时，倾斜试管，尽力排出液面上益的石蜡油，将材料接种在肉汤内，接种完后让石蜡油重新覆盖在液面，置于37℃温箱中培养。

（2）高层琼脂柱培养法

把含1%葡萄糖的琼脂培养基制成高层（达管高的2/3以上）。以穿刺接种法接种厌氧菌，用烧灼接种环融封穿刺孔，置于37℃温箱中培养。

（3）生物学厌氧培养法

将葡萄糖琼脂平板用蜡笔在底部画成二半，一半接种需氧菌， 另一半接种厌氧菌。前者如灵杆菌、大肠杆菌等，后者如魏氏梭菌等。移植完后，盖好平板，并以熔化石蜡封固边缘，置于37℃温箱中培养；亦可用新鲜马铃薯或萝卜按每升约50g置于密封容器内与接种的厌氧菌共同培养。

（4）焦性没食子酸法

利用焦性没食子酸与碱作用生成焦性没食子橙的过程中要大量吸收氧的原理进行厌氧培养。通常l00cm2空间用焦性没食子酸1g，10%NaOH或氢氧化钾10mL。常用的方法有试管培养法、平板培养法、干燥器培养法。  

（5）二氧化碳培养法

少数细菌如牛型布氏杆菌，在含有5%～10%的二氧化碳环境下生长良好，常用的方法为烛缸法。取干燥器（盖口抹上凡上林），将接种好的平板或斜面放入器内，点燃燃烛直立于缸的隔板上，盖上盖子，因器内氧气耗尽蜡烛自灭，所含二氧化碳仅约10%左右。